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人宫颈癌细胞HeLa购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。HeLa细胞培养使用DMEM培养基(SH30243.01, Hyclone),培养基中添加10% FBS (F8687, Sigma)、1%青霉素-链霉素(C0222, 碧云天),在体积分数为5% CO2的37 ºC的培养箱中培养。
人纤维肉瘤细胞HT-1080购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。HT-1080细胞培养使用MEM培养基(SH30265.01, Hyclone),培养基中添加10% FBS、1%非必需氨基酸(SH30238.01, Hyclone)、1%青霉素-链霉素,在体积分数为5% CO2的37 ºC的培养箱中培养。
用于STORM成像的细胞为复苏后第3-10代细胞,细胞种植于超分辨成像专用35 mm玻璃底培养皿(P35G-1.5-20-C, MatTek)中,密度约105细胞每皿。HT-1080细胞培养24 h后加入10 μmol/L EdU同时加入不同浓度TSA(100, 200, 400, 600 nmol/L),继续培养24 h后固定。HeLa细胞种植后培养24 h,加入10 μmol/L EdU,继续培养24 h后进行X射线辐照,孵育30 min后固定,剂量为1 Gy,剂量率188.5 cGy/min (X-Rad225, PRECISION)。
稳定表达GFP-XRCC1融合蛋白的人纤维肉瘤细胞HT-1080获赠于北京大学杨根博士。GFP-XRCC1-HT-1080细胞培养于微束终端活细胞成像专用细胞盘内,使用DMEM培养基,培养基中添加10% FBS、1%青霉素-链霉素, 在体积分数为5% CO2的37 ºC的培养箱中培养。12 h种植后加入不同浓度TSA(100, 200, 400, 600 nmol/L),孵育12 h后更换含10% FBS的活细胞成像液(A14291DJ, ThermoFisher),并进行重离子辐照及活细胞成像。
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通过在培养基中加入一种胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸类似物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine),细胞在DNA复制时将EdU掺入DNA中实现高密度标记。固定后的细胞按BeyoClick Edu-647试剂盒(C0081S, 碧云天)提供说明书进行细胞通透与“点击化学”反应,使细胞DNA连接上Alexa Fluor 647荧光分子。成像时需使用含β-巯基乙醇(β-ME)等还原性巯基分子的成像液[2]。STORM拍摄时使用高强度647 nm激光使大部分荧光分子进入暗稳态,再使用低强度405 nm激光使少数荧光分子回到基态。基态的荧光分子受激发光被电子倍增电耦合相机(Electron Multiplying Charge Coupled Device, EMCCD)捕获,拍摄帧数15 000帧。得到的图像用Insight3软件(由加利福利亚大学Bo Huang博士提供)进行拟合,拟合完成后由自主研发的算法进行图像漂移矫正。
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HeLa细胞核内DNA的STORM单分子超分辨成像表明,核内染色质的分布存在几十纳米的团簇结构[2]。为了对染色质结构定量表征,定义任一团簇的最近邻距离NND为该团簇与距其最近的团簇结构的质心间距离,它的分布反映了核内染色质的DNA团簇的密度分布。在开源图像处理软件Image J插件FociPicker3D基础上我们提出了一种团簇的最近邻距离分析算法NND Analyzer(Nearest Neighbour Distance Analyzer)。该算法首先用FociPicker3D分析STORM单分子图像,根据获得的荧光分子局域分布密度特征识别出染色质团簇结构[14],然后测量得到这些团簇结构的面积、单分子密度/数量、质心位置等信息,计算所有团簇的NND距离并对间距250 nm内的NND进行分布统计即得到该细胞核内染色质的团簇定量表征。由于图像中的分子数密度可能影响FociPicker3D对团簇结构的识别和分析,我们进行了不同分子数密度的STORM图像模拟和最近邻距离分析,分析证明,在与实验获取图像相同的分子数密度范围内,根据模拟图像所获得的分子团簇识别与最近邻距离分布对染色质结构分析无影响。为保证实验结果可靠性,本工作中所有细胞核的STORM图像的单分子密度均为4.3分子每百像素,所展示的重构单分子图像(图1)均采用相同对比度设置。
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活细胞辐照和在线显微荧光观察实验在兰州重离子研究装置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou, HIRFL)加速器的高能微束装置的大气辐照终端进行,实验束流为6.5 MeV/u的Kr离子和25 MeV/u的Ar离子,它们在细胞中的线性能量转移LET分别为约5×103 keV/μm和870 keV/μm。实验时将活细胞培养盘置于微束装置的细胞成像系统显微镜样品台,保持细胞培养皿处于37 ºC恒温状态,调整束流强度使成像视野中每细胞辐照约5个离子每秒[15]。辐照前开始采集图像,每10 s采集一次并储存,采集5帧后开始辐照,采集时长共600 s。采集完成后依次选取每帧中细胞核区域、背景区域和荧光聚点区域并测量其荧光强度,按式(1)计算荧光聚点相对荧光强度,得到荧光强度随时间的变化曲线,再根据式(2)进行拟合,计算得出XRCC1募集到损伤位点的速率常数
$ {k}_{1} $ ,公式如下:$$\begin{split} \\ {I}_{\mathrm{r e l}}=\frac{{I}_{\mathrm{f o c i}}-{I}_{\mathrm{b a c k g r o u n d}}}{{I}_{\mathrm{n u c l e u s}}-{I}_{\mathrm{b a c k g r o u n d}}} \text{,} \end{split} $$ (1) $$ {I}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}={I}_{0}+{I}_{1}\times (1-{e}^{-{k}_{1}t}) \text{,} $$ (2) 其中:
$ {I}_{\mathrm{r e l}} $ 为相对荧光强度;$ {I}_{\mathrm{f o c i}} $ 为荧光聚点内平均荧光强度;$ {I}_{\mathrm{b a c k g r o u n d}} $ 为背景区域平均荧光强度;$ {I}_{\mathrm{n u c l e u s}} $ 为细胞核平均荧光强度;$ {I}_{0} $ 为辐照前聚点位置处XRCC1相对荧光值;$ {I}_{1} $ 为与损伤DNA结合的XRCC1的荧光强度;$ {k}_{1} $ 为XRCC1募集速率常数。
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摘要: 真核生物的DNA分子经高度压缩以染色质形式存在于细胞核中,染色质动态结构在DNA复制、基因转录和DNA修复等过程中起着重要的调控作用。核内染色质结构的原位高分辨解析和其结构变化定量表征一直受困于显微成像观测分辨率的限制。通过点击化学荧光标记EdU和STORM单分子定位显微成像,实验得到了细胞核内超分辨率染色质结构图像。基于提出的单分子团簇分析和最近邻距离算法分析发现,X射线辐照和TSA处理后的细胞核内核小体团簇数量显著增多,核小体团簇所占细胞核内的面积比相对于对照组增加,且团簇内平均EdU分子数降低。同时,重离子辐照活细胞在线成像实验获得的XRCC1招募动力学速率常数表明乙酰化处理使得DNA损伤密度降低。这些结果表明电离辐射和乙酰化处理均导致了染色质结构的松散化。STORM超分辨成像方法和分析算法及其获得的核小体团簇分布规律为染色质结构的松散提供了直接的定量表征数据支持。Abstract: Eukaryotic DNA molecule is highly compressed and exist in the form of chromatin in the nucleus. The dynamic structure of chromatin plays an important role in the process of DNA replication, gene transcription and DNA repair. In situ high-resolution analysis of chromatin structure and quantitative characterization of its structural changes have been limited by the optical resolution of microscopic imaging. The super-resolution chromatin structure image in the nucleus was obtained by click-reaction labeled EdU and the STORM single-molecule-localization microscopy. Based on the proposed single molecule cluster analysis and nearest neighbor distance algorithm, we found that the number of nuclear nucleosome clusters increased significantly after X-ray irradiation and TSA treatment, the area ratio of nucleosome clusters in the cell nucleus increased compared with the control group, and the average number of EdU molecules in the cluster decreased. At the same time, the rate constant of XRCC1 recruitment kinetics obtained from the on-line imaging experiment of heavy ion irradiated living cells showed that acetylation reduced the density of DNA damage. These results showed that both ionizing radiation and acetylation led to the decondensation of chromatin structure. The imaging method, analysis algorithm and the distribution of nucleosome clusters provide direct quantitative characterization data support for the decondensation of chromatin structure in cell nucleus.
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图 4 Kr离子辐射引起的荧光聚点动态及修复蛋白XRCC1招募速率常数变化(在线彩图)
(a) 25 MeV/u的Ar离子辐照后细胞内荧光聚点强度随时间变化,重离子随机辐照细胞核各区域,辐照开始时的时间定义为0 s;(b) 6.5 MeV/u的Kr离子辐照后300 s内不同浓度TSA处理下细胞内荧光聚点相对荧光强度变化,已作归一化处理(50 s时开始辐照);(c) 25 MeV/u的Ar离子辐照后300 s内不同浓度TSA处理下细胞内荧光聚点相对荧光强度变化,已作归一化处理;(d) 6.5 MeV/u的Kr离子辐照后不同浓度TSA处理下XRCC1的招募速率常数${k}_{1} $变化(黑色曲线,0 nmol/L组6细胞,100~200 nmol/L组各5细胞,400 nmol/L组6细胞,600 nmol/L组8细胞);25 MeV/u的Kr离子辐照后不同浓度TSA处理下XRCC1的招募速率常数${k}_{1} $变化。(红色曲线0 nmol/L组4细胞,100 nmol/L组9细胞,200 nmol/L组5细胞,400 nmol/L组4细胞,600 nmol/L组5细胞)。
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