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高分子聚合物薄膜经过高能重离子辐照后,会在薄膜中沿着离子入射路径形成直径约为10 nm的柱状损伤区(潜径迹),经过适当条件的化学蚀刻会形成直径十几nm到几十μm的微孔,这种利用离子辐照技术制备的微孔膜被称为核孔膜。与其它形式的膜材料相比,核孔膜的孔分布均匀,孔径均匀且方便可调,孔道为直通孔,孔道内壁及膜表面光滑平整,可以根据需求选择不同材质的聚合物薄膜制备核孔膜[1]。以上优点使得核孔膜具有广泛的应用前景,比如可以作为模板制备一维纳米材料[2],通过调整孔径大小实现对有机物分子、气体分子和离子等的精准分离[3],污水处理等。
中医药学已有数千年的历史,然而由于中药水提液体系成分复杂,在中药制成各种方剂之前需要进行分离纯化。近几十年,醇沉工艺是我国中药生产企业首选的分离精制技术之一,《中国药典》上几乎所有的中药口服液和中药注射剂的制法都涉及醇沉工艺[4]。醇沉工艺主要的流程是在中药水提液中加入适量乙醇,使水提液中不溶于醇的大部分蛋白质、淀粉等杂质通过沉淀除去,保留溶解在水和乙醇中的生物碱、苷类、有机酸等有效组分[5]。虽然醇沉工艺应用广泛,但是仍然存在一些不足,如除杂不完全[4],存在有效成分的流失,耗醇量大、耗时长、能耗高、不符合绿色制造的理念等的问题[6]。在解决现有醇沉工艺不足的同时,探索高效、绿色、精准的中药水提液分离与纯化方法成为中医药现代化的重要研究方向。
中药药效物质,如生物碱、苷类等,其分子量一般小于1 000,并且成分复杂,在使用过程中它们多靶点提供药效。因此,在中药分离纯化的过程中,应完整保留原处方中分子量小于1 000的化学成分[7-8]。膜分离技术是一种清洁有效的提纯分离方法,可以实现对特定分子量有效物质的筛分,具有节能、环保、高效等特点,被认为是我国中药制药工业上急需推广的高新技术之一[8]。常用有机物分离膜的膜结构多为网状孔结构,通量高但易堵塞,与之相比,核孔膜的孔径均匀可控,可以精准分离某一尺度、分子量区段的有效成分,契合中药分离的核心需求,并且材质清洁,不会造成水提液的污染。
本研究通过制备不同孔径的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)核孔膜,用于中药分离的三个过程:首先用一系列微米级孔径的核孔膜对中药水提液进行微滤,研究过滤效果、料液理化性质的变化以及膜的连续过滤通量;然后针对水提液中大分子量杂质(蛋白质和淀粉)进行分离,研究分离效果和料液中药有效成分的变化;最后对核孔膜进行修饰,使其可以截留中药有效成分中的小分子有机物,达到浓缩提纯的效果;此外,还考查了核孔膜对其它物质的截留效果。
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本实验所用表征仪器有:美国FEI Nova Nano SEM 450场发射扫描电镜;英国Malvern Nano ZS90型激光粒度仪;Brookfield DV-Ⅱ可编程控制式粘度计;雷磁PHS-3C pH计;雷磁DDS-307A 电导率仪;Waters e2695高效液相色谱仪配2998二极管阵列(PDA)检测器;Perkin Elmer Lambda 1050紫外-可见光分光光度计。过滤装置是杭州赛菲膜分离技术有限公司生产的膜性能评价仪。
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首先利用兰州重离子研究装置(HIRFL)提供的能量为19.5 MeV/u的129Xe离子束对不同规格的PET薄膜进行辐照,辐照注量在105~109 ions∙cm−2之间,然后用功率为13.08 mW/cm2的紫外光对重离子辐照过的聚合物薄膜双面各敏化1 h,接着在50 ºC、5 mol/L的NaOH蚀刻液中进行蚀刻,通过改变蚀刻时间获得具有不同孔径的核孔膜。
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过滤方式选用错流过滤,PET核孔滤膜有效过滤面积为8.04 cm2。滤膜通量测试方法:根据不同膜的预估通量,分不同的时间间隔(分别是1, 2, 5 min),得到每段时间间隔的滤出液体积,将每段时间间隔内末尾时刻的料液通量用该段时间内的平均通量代替,料液通量按照下式计算:
其中:V为滤出液体积;A为有效过滤面积;t为时间间隔;通量单位是LMH,即L/(m2∙h)。
分子截留率按下式计算:
分子透过率按下式计算:
其中:Cp为透过液中分子含量(mg/L);Cf为原料液中分子含量(mg/L)。
通过分析甘草水提液过滤前后的特征图谱,研究过滤过程对中药有效成分的影响,检测方法如下[9]:色谱柱为XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相是乙腈−0.05%磷酸水溶液,流动相梯度洗脱,具体比例见表1;检测波长为237 nm;特征峰是甘草苷(保留时间约为6 min)和甘草酸(保留时间约为12 min)。
t/min V(乙腈)/% V(0.05%磷酸)/% 0 25 75 1 25 75 12 60 40 13 25 75 16 25 75 -
中药水提液的制备:取药材10 g加30倍水煎2 h,倒出第一遍煎液,再加30倍水煎2 h,合并两次煎液用纱布过滤后定容,制得500 mL中药水提液。金银花从康美药业购入,执行标准为《中国药典》2015年版;当归和甘草从安徽惠丰国药购入,当归执行标准为《中国药典》2020年版,甘草执行标准为《中国药典》2015年版。
中药水提液微滤实验中用到的核孔膜参数如表2所列。错流过滤实验在105 Pa的操作压力下进行,并测试过滤前后料液的粘度、色度、pH值、电导率和颗粒物尺寸及分布,实时监测滤膜过滤料液时的通量变化。
孔径/μm 辐照注量/(ions∙cm−2) 薄膜厚度/μm 15 1×105 15 10 1×105 20 5 6×105 10 1 2×107 12 -
选用注量为2.55×109 ions∙cm−2、厚度为8 μm的PET原膜,蚀刻150 s,经水洗烘干得到相应核孔膜。错流过滤实验在105 Pa的操作压力下进行,料液为核孔膜微滤后的甘草水提液、100 mg/L的大豆分离蛋白溶液和100 mg/L的可溶性淀粉溶液。
采用考马斯亮蓝G-250染色法进行过滤前后料液中的蛋白质含量变化检测。取0.1 g考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%乙醇中,加100 mL 85%磷酸,加水稀释至1 L。分别取0.5 mL试样和水,加3 mL染色液混合静置15 min后,用紫外分光光度计于595 nm波长处比色[10]。
采用碘显色法进行过滤前后料液中的淀粉含量变化检测。取0.65 g碘和2 g碘化钾加入500 mL无水乙醇中溶解,得到碘试液。分别取5 mL水和试样置于100 mL容量瓶中,加入1.5 mL碘试液后定容,用紫外分光光度计在570 nm波长处比色[11]。
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将5 mL浓氨水逐滴加入150 mL 0.013 mol/L的AgNO3溶液中,并将厚度为12 μm、注量为2.55×109 ions∙cm−2、蚀刻150 s的PET核孔膜完全浸入,然后加入10 mL 0.39 mol/L的葡萄糖溶液进行反应。反应结束后,用去离子水和乙醇充分清洗并于70 ºC真空干燥[12]。错流过滤实验在6×105 Pa 的操作压力下进行,料液为100 mg/L绿原酸水溶液、50 mg/L橙皮苷甲醇溶液、50 mg/L咖啡酸水溶液、30 mg/L芍药苷甲醇溶液、1 mg/L考马斯亮蓝水溶液、4 mg/L刚果红水溶液、0.5 mg/L罗丹明B水溶液。绿原酸、橙皮苷、咖啡酸和芍药苷均为中药有效成分,利用高效液相色谱仪表征过滤前后含量的变化[13-15];考马斯亮蓝、刚果红和罗丹明B为染料分子,用紫外分光光度计表征其含量的变化。
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1) 微滤效果研究
当归水提液经过两层纱布过滤后仍然浑浊,且絮状杂质明显可见。然而经过不同孔径核孔膜过滤后,逐渐变得澄清,如图1所示。本工作将滤出的杂质进行表征,水提液滤出的杂质形貌和过滤实验后核孔膜(15 μm孔径)的表面形貌如图2所示。可以看出,中药水提液的杂质中存在大量植物组织,其尺度在50 μm左右,远大于所用核孔膜孔径尺寸,该尺度物质为微滤的目标物质,水提液变澄清和该杂质滤除密切相关,证明核孔膜在中药水提液微滤过程中发挥着重要作用,且过滤效果良好。
为进一步研究核孔膜过滤后水提液颗粒物的变化情况,实验将经过10, 5, 1 μm孔径核孔膜过滤后的料液和原料液进行了粒径测试。图3为金银花水提液和当归水提液分别经过孔径为10, 5 , 1 μm的核孔膜之后,料液中颗粒物体积百分比随颗粒物尺寸的分布情况。通过分析颗粒物粒径分布变化,可以看出逐级过滤后颗粒物粒径的分布峰位均向小尺寸方向移动,表明核孔膜过滤后,水提液中的大尺寸颗粒物明显减少;同时,随着过滤膜孔径减小,水提液中残留颗粒物尺寸分布更加集中。核孔膜孔径越小,这种效果越明显,表明核孔膜孔径分布均匀[16]。颗粒物粒径的分布变化和水提液逐渐澄清的现象一致。由于不同的药材取自于不同植物的不同器官组织,引入的微米尺度杂质也不尽相同,各种药材水提液的特性差异会导致其中的颗粒物粒径分布不同。根据核孔膜微滤后水提液的粒径分布情况,发现当归水提液中的亚微米尺度杂质尺寸约为400 nm,金银花水提液中亚微米尺度杂质尺寸约为600 nm。
2) 过滤前后料液理化性质研究
为研究核孔膜过滤前后料液的理化性质变化,对料液粘度、色度、pH值和电导率进行了分析。表3是金银花水提液和当归水提液分别经过10, 5 , 1 μm的核孔膜过滤之后的理化性质参数。可见在过滤之后,中药水提液的粘度、色度、pH值和电导率均未发生明显变化,说明基于核孔膜的分离过程清洁,并未影响中药水提液的性质 [17]。
粘度/(mPa·s) 色度/度 pH 电导率/(μS·cm−1) 金银花 原液 4.0 1 250 5.53 979 10 μm 3.9 1 250 5.46 1 124 5 μm 4.1 1 250 5.46 1 029 1 μm 3.4 1 250 5.43 1 145 当归 原液 3.0 600 5.64 929 10 μm 4.5 600 5.65 874 5 μm 3.6 600 5.62 1 016 1 μm 3.5 600 5.64 958 由于中药的特征图谱能够较为全面地反映中药水提液中所含有效成分的种类与含量,为研究核孔膜分离过程对中药有效成分含量的影响,对甘草水提液原液和经过核孔膜微滤透过液的特征图谱进行测试和分析。甘草水提液经1 μm孔径核孔膜过滤后,其透过液图谱与原液图谱相比,特性峰强度和形状均未发生明显变化 (如图4所示),表明核孔膜的微滤过程并未影响水提液的物质组成和料液性质。通过计算透过液和原液的峰面积及其比值发现,经多级核孔膜微滤后,甘草苷透过率为97.15%,甘草酸透过率为94.78%,表明多级核孔膜微滤后,中药水提液有效成分含量仍然可达94%以上。
3) 核孔膜中药水提液通量研究
通量是表征膜性质的重要参数,本工作为获得核孔膜用于中药水提液微滤过程中的通量变化,对四种孔径核孔膜的中药水提液通量进行了研究。该实验中,过滤方式为错流过滤,错流过滤使料液沿与膜平行的方向流动借此产生较高的剪切力,使沉积在膜表面的颗粒返回料液主体以保证滤饼层处于较薄的水平[18]。从图5(a)中可以看出,孔径为15 和10 μm的核孔膜初始通量分别为10 000和8 000 LMH左右,10 min后通量开始快速衰减,30 min后,膜表面的滤饼层厚度基本达到恒定,膜通量也保持稳定,其中15 μm孔径核孔膜通量稳定在5 900 LMH左右,10 μm孔径核孔膜稳定在6 300 LMH左右。由于过滤过程为逐级过滤,10 μm孔径核孔膜过滤的料液为15 μm孔径核孔膜纯化后的料液,因此,10 μm孔径核孔膜最后稳定通量大于15 μm孔径核孔膜的通量,这种通量差异也证明了逐级过滤的优势及必要性。5 μm孔径核孔膜的通量变化如图5(b)所示,20 min之后,膜通量趋于稳定,维持在290 LMH左右;此时停止过滤,将膜取出进行清洗,膜通量可恢复到原来的80%。图5(c)是1 μm孔径核孔膜的通量变化,在8 min之后,通量趋于稳定,并维持在80 LMH左右;此时清洗滤膜,膜通量可恢复到原来的55%。1和5 μm孔径核孔膜通量在测试初始阶段会急速衰减,随着过滤时间的延长,维持在相对稳定的数值。洗涤之后,膜通量显著恢复,说明杂质对核孔膜主要造成的是可逆污染。由于核孔膜孔径均一、为直通孔且孔道内壁光滑,所以大颗粒杂质不会进入孔道吸附在孔道内壁形成不可逆污染,而是在膜表面形成一层杂质层,并造成膜通量下降。经过清洗,杂质层被去除后,膜通量可恢复,证明核孔膜具有抗污染性,可以通过清洗、反冲洗等方式恢复过滤性能[16],实现连续过滤。
此外,通过对照核孔膜和商业过滤膜(尼龙66)在过滤后和清洗后的表观变化,发现经过错流过滤后,核孔膜表面杂质形成的滤饼层很薄,而在清洗过后,核孔滤膜完全恢复原来的形貌[图6(a)和(b)所示];而商业膜并非直通孔道,内部是疏松多孔的网状孔,在错流过滤中药水提液时,通量会急速降为零,料液杂质进入到分离膜的内部网格中,清洗和反冲均无法恢复原有形貌及分离性能[图6(c)~(f)所示]。结合核孔膜清洗后通量可恢复的数据,证明核孔膜比一般商用分离膜抗污染性能好,适合工业化连续过滤操作。
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中药水提液中含有大量的共性高分子物质,如淀粉、蛋白质等,醇沉法主要去除的对象为该部分杂质,它们是中药精制过程中的无效成分,会在中药提取物的固含物中占有较高比重,影响高纯度、符合药品标准的原料药的生产[4]。因此,本工作开展了膜过滤方法对中药水提液中蛋白质和淀粉的截留实验研究,考查核孔膜对水提液中蛋白质和淀粉去除效果。
在蛋白质和淀粉的去除实验中,使用厚度为8 μm、注量为2.55×109 ions∙cm−2的核孔膜,孔径为50~60 nm,错流过滤在105 Pa操作压力下进行,水通量为14.81 LMH。选择进行分离的料液是100 mg/L的大豆分离蛋白溶液和100 mg/L的可溶性淀粉溶液;由于甘草中蛋白质和淀粉含量较高,经核孔膜微滤后的甘草水提液也作为料液进行分离纯化[19]。
将原液和透过液分别用考马斯亮蓝G-250染色法和碘显色法对其进行处理,然后用紫外分光光度计进行检验。过滤前后结果如表4所列 ,甘草水提液中确实含有蛋白质和淀粉,但经过过滤后,甘草水提液和可溶性淀粉溶液、大豆分离蛋白溶液中的蛋白质和淀粉均被截留。实验结果表明孔径50~60 nm的核孔膜可以完全滤除中药水提液中的大分子有机物杂质。
料液 蛋白质 淀粉 截留率 甘草水提液透过液 未检出 未检出 100% 100 mg/L可溶性淀粉透过液 - 未检出 100% 100 mg/L大豆分离蛋白透过液 未检出 - 100% 为明确核孔膜滤除蛋白质和淀粉过程对中药水提液中组分含量的影响[20],实验研究了甘草水提液过滤前后料液的特征图谱。如图7所示,可以看出原液和透过液图谱形状没有发生变化,说明核孔膜的过滤过程没有影响水提液整体的物质组成和料液性质。通过对比计算原液和透过液中关键成分峰面积,甘草苷的透过率为77.81%、甘草酸的透过率为70.82%。在其它方法中,经过醇沉法多次浸提,苷类和酚酸类有机物的保留率为70%~80%[21],中药水提液中蛋白质的去除率为40%~80%[5];絮凝法除杂过程中,甘草酸保留率为76.7%[22],蛋白质去除率为69.8%[22]。由此可见,与其它方法相比,核孔膜的有机物透过率(即保留率)与醇沉法和絮凝法相当,但是大分子去除率可高达100%。
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核孔膜为直通孔,有确定且均匀的孔径,孔径可以通过改变蚀刻条件进行精准调控。但是当前实验中核孔膜厚度为微米量级,仅通过控制蚀刻条件难以获得孔径约为10 nm的核孔膜。为精准控制中药有效成分的透过与截留,对核孔膜孔道进行修饰和 “缩孔”。首先将核孔膜浸泡在银氨溶液中,再加入葡萄糖溶液对银氨根离子进行还原,由于核孔膜孔道具有丰富的羧基基团,可以作为银还原的结合位点,使得核孔膜孔道附上一层银单质,进而实现“缩孔”的目的。
选择孔径约为50 nm、厚度为12 μm、注量为2.55×109 ions∙cm−2的核孔膜,修饰后的水通量为13.12 LMH。图8(a)和(b)分别为核孔膜修饰前后的扫描电镜照片,发现修饰后孔径较修饰之前有明显减小。通过考查修饰后核孔膜对染料分子和某些中药有效成分的透过率(如表5),发现该膜对于染料分子的截留率均在90%以上,对分子量为300~600的中药有效成分截留率在50%左右,对于分子量100左右的有机小分子透过率超过90%[23-24]。结果表明,核孔膜经过可控修饰后,可以精准截留特定分子量范围的有机物,扩展了核孔膜在有机物小分子纳滤中的应用,使核孔膜有能力在分子尺度范围内进行中药精制。
名称 分子量 透过率/% 咖啡酸 180.15 94.02 绿原酸 354.31 49.68 芍药苷 480.45 53.80 橙皮苷 610.56 51.00 罗丹明B 479.01 10.40 刚果红 696.66 11.15 考马斯亮蓝 858.05 3.41 为研究修饰后核孔膜的抗污染性能,利用核孔膜和商用膜(尼龙66)在相同条件下截留考马斯亮蓝,并对两种膜在醇洗前后的表观变化进行对比。发现核孔膜在过滤染料后经过醇洗可基本恢复原来形貌[图9(a)和(b)所示],但是受污染的网状孔商用膜内部残留的杂质无法被洗出,污染物仍然残存在膜的表面和内部[图9(c)和(d)所示],研究结果表明核孔膜在修饰后依然具有抗污染性能。
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通过制备不同孔径和参数的核孔膜,将其应用于中药水提液的微滤、超滤和纳滤实验,结果表明核孔膜可以精准截留相应杂质,将料液中的颗粒物尺寸控制在一定较窄范围内,并且对于尺度小于核孔膜孔径的物质具有很高的透过率。水提液经微滤后,可以除去尺寸大于1 μm的杂质,料液过滤后变澄清但不会改变水提液中有效成分种类和含量,有效成分保留率在94%以上;水提液经50~60 nm孔径的核孔膜过滤后,蛋白质及淀粉可完全被去除,有效成分保留率在70%以上;在有机物小分子纳滤实验中,提出了一种新的孔道修饰方法,核孔膜通过孔道修饰,可以实现对中药有效成分的分离和截留。总之,本工作通过调控核孔膜孔径等参数,实现了对中药水提液的多级过滤和分离,证明利用核孔膜开展中药分离和纯化切实可行,为中药分离纯化提供了一种新的技术方案,对核孔膜用于其它复杂体系的分离和纯化同样具有重要参考价值。
Study on the Application of PET Ion-track Etched Membrane in Separation and Purification Traditional Chinese Medicine Water Extract
doi: 10.11804/NuclPhysRev.40.2022028
- Received Date: 2022-04-08
- Rev Recd Date: 2022-06-18
- Publish Date: 2023-06-20
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Key words:
- ion-track etched membrane /
- clarification and refinement of traditional Chinese medicine /
- membrane process
Abstract: The components of Chinese medicine water extract are complex. With the development of traditional Chinese medicine pharmacy, it is urgent to establish a simple and effective separation and purification method for traditional Chinese medicine. Membrane separation technology, as a simple, direct and efficient material separation method, is widely used in the separation and purification of traditional Chinese medicine because of its low energy consumption and no secondary pollution. Using the ion-track etched membrane with different pore diameters to filter the Chinese medicine water extract in multiple steps, and characterizing the filtrate. The impurities above 1 μm can be removed through microfiltration without changing the properties of water extract. Besides, the proteins and starches can also be removed through ultrafiltration. After modification, the active components of traditional Chinese medicine, like paeoniflorin and chlorogenic acid, can be separated by the ion-track etched membrane. The results show that the ion-track etched membrane can be applied to the process of separation and purification of Chinese medicine water extract, which proves that the ion-track etched membrane can be used for the separation and purification of Chinese medicine water extract.
Citation: | Xingfan WANG, Shengming MA, Xiaoyu GUI, Jingyi MA, Dan MO, Jinglai DUAN, Jie LIU, Huijun YAO. Study on the Application of PET Ion-track Etched Membrane in Separation and Purification Traditional Chinese Medicine Water Extract[J]. Nuclear Physics Review, 2023, 40(2): 264-272. doi: 10.11804/NuclPhysRev.40.2022028 |