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本文所用到的细胞系Calu-1和H1299均来自于ATCC细胞库。细胞培养液由DMEM高糖培养基(Gibco,澳洲)、10%胎牛血清(Gibco,澳洲)、另外添加1% 青霉素和链霉素混合液(其中青霉素工作浓度为100 U/mL,硫酸链霉素的工作浓度为0.1 mg/mL)配置而成。细胞在37 ºC培养箱培养,CO2的体积分数为5%。
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本文中所有的射线处理均为X射线。主要采用苏州大学放射医学与辐射防护国家重点实验室仪器平台的PXi X-RAD 225Cx/SmART小动物放疗模拟定位机进行(Precision X-Ray Inc., 美国)。管电压225 kV,照射功率3 kW,开放野剂量率为4.48 Gy/min。细胞照射剂量为4 Gy,照射后2 h收集细胞样品。
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细胞密度达到80%后,加入100 nmol/L Swinholide A处理6 h,然后用RNA提取试剂盒(碧云天,中国)收集总RNA;样品总RNA利用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific,美国)定量后逆转录为cDNA;进而用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cDNA;标记好的cDNA和芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像;采用Feature Extraction 软件 (version10.7.1.1, Agilent Technologies, 美国)进行数据分析和处理;统计变化差异并采用T检验进行差异lncRNA筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值
$\geqslant$ 2.0倍且P$ \leqslant $ 0.05。 -
细胞在4 Gy照射后2 h,将TRIzol试剂(Invitrogen,美国)按照每1×106个细胞加入1 mL的量加入培养皿中。将加入TRIzol裂解的细胞样品在冰上静置2 min后,用移液器反复吹打,直至所有的细胞都被裂解完毕。用RNA提取试剂盒提取TRIzol中的总RNA并用Nanodrop测定总RNA浓度。抽取1 μg RNA,采用All-in One TM RNA qRT-PCR检测试剂盒(Genecopoeia, 美国)将RNA逆转录为cDNA备用。采用SYBR Green PCR master Mix荧光定量试剂盒(GeneCopoeia,美国)进行测定。所有目的基因或RNA的引物由上海生工生物科技有限公司(上海,中国)合成,PCR引物序列见表1。PCR程序采用Chromo4系统(Bio-Rad, 美国),然后分别预变性95 ºC 5 min、变性95 ºC 5 s、退火60 ºC 20 s、延伸72 ºC 20 s,共设计42个循环。用Ct数值比较法检测基因的表达差异。设置独立的3次生物学重复。
表 1 引物序列
lncRNA或
基因名称引物序列5’-3’ 扩增产物
长度(bp)GAPDH 正向:ATTCCACCCATGGCAAATTCC
反向:GACTCCACGACGTACTCAGC145 XR_923281 正向:GCCAAGGTTTGTAGCTGTGC
反向:TGGTTTCAGGACAACGCAGT276 XR_930632 正向:AAGGGAAAGTCCTGAACGCC
反向:GCAACTCTCCTCCTACTCGC152 XR_942150 正向:AGCACAGACCTCAGGGTGAA
反向:TATGTGGAGGCTGACTCCCT732 XR_001755972 正向:CAAAGGGAAGCCGTAGCAGA
反向:GCTCAGACCAGACAGGGTTC266 XR_002956697 正向:AGGCTGCCTTAAAACCCCAG
反向:TGAGGTCAACACGATTTCCGT114 XR_923639 正向:GGTTCCATCCCATCCGCCT
反向:AAAAACCGCAGAGTCCACCT202 XR_01739734 正向:AGCGACAAAGACGGTTTCCT
反向:ACCTTTTCCGCCAGTGCATA264 XR_923426 正向:GAAGTGGGACAGGGAGCATT
反向:CAGTAGGCTTGTTCCTTGCC129 -
将细胞种植在预置15 mm直径圆形玻璃片的培养皿中,细胞在4 Gy X射线照射后2 h或100 nmol/L Swinholide A处理后6 h后,在培养皿中加入用预热的4%多聚甲醛室温固定15 min后,使用PBS润洗培养皿并覆盖细胞,向培养皿中加入工作浓度5 μg/mL 的Fluo488标记的鬼笔环肽(Phalloidin, CST,美国)染色20 min。最后,用PBS洗去鬼笔环肽染色液,用DAPI (Sigma,美国)染核后,将15 mm玻璃片取出并在共聚焦显微镜下镜检、拍照、获取实验数据。
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对获取的数据进行双尾Student’s t检验比较。目标基因或RNA的表达统计为平均值±SEM。在所有实验中,P值小于0.05被认为有显著差异,其中P值小于0.05标记为*,P值小于0.01标记为**,P值小于0.001标记为***。使用GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software Inc., 美国)作图并统计。
Long Non-coding RNA XR_923426 Participates in the Regulation of Microfilament Dynamics Induced by Ionizing Radiation
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摘要: 细胞微丝骨架是多功能亚细胞结构,是电离辐射的感受器也是效应器。为了明确长链非编码RNA(lncRNA)是否参与调控电离辐射引起的微丝骨架动力学变化,采用Swinholide A处理诱导细胞微丝骨架解聚之后,进行lncRNA组学分析并验证差异表达的lncRNA;采用鬼笔环肽染色和微丝网络结构分析等方法评价电离辐射引起微丝骨架动力学变化的程度。结果发现,微丝骨架解聚后,lncRNA XR_923426的表达下调;人为上调lncRNA XR_923426的表达水平能够显著缓解辐射导致的微丝骨架结构异常和微丝网络连接减少。这些发现为微丝通过lncRNA调控辐射导致细胞死亡或肿瘤转移的机制提供了新的研究思路,有望成为肿瘤治疗和正常组织辐射防护的新靶点。Abstract: Microfilament is a multi-functional sub-cell structure, and it is also a sensor for ionizing radiation. In order to clarify the regulatory effect of long non-coding RNAs(lncRNA) in the alteration of microfilament dynamics caused by ionizing radiation, Swinholide A was used to depolymerize the microfilament and then, the lncRNA chip was used to detect the differentially expressed lncRNAs. Microfilament staining and network/structure analysis were used to evaluate the changes in microfilament skeleton. It was found that the expression of lncRNA XR_923426 was decreased after the microfilament depolymerization. Meanwhile, the overexpression of lncRNA XR_923426 could significantly alleviate the microfilament depolymerization caused by ionizing radiation. This provides a new clue for the research on the regulatory relationship between lncRNA targeted microfilament dynamics and radiation induced tumor death or metastasis, which is expected to develop into a new target for tumor treatment or normal tissue protection.
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Key words:
- ionizing radiation /
- long non-coding RNA /
- microfilament /
- cytoskeleton
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表 1 引物序列
lncRNA或
基因名称引物序列5’-3’ 扩增产物
长度(bp)GAPDH 正向:ATTCCACCCATGGCAAATTCC
反向:GACTCCACGACGTACTCAGC145 XR_923281 正向:GCCAAGGTTTGTAGCTGTGC
反向:TGGTTTCAGGACAACGCAGT276 XR_930632 正向:AAGGGAAAGTCCTGAACGCC
反向:GCAACTCTCCTCCTACTCGC152 XR_942150 正向:AGCACAGACCTCAGGGTGAA
反向:TATGTGGAGGCTGACTCCCT732 XR_001755972 正向:CAAAGGGAAGCCGTAGCAGA
反向:GCTCAGACCAGACAGGGTTC266 XR_002956697 正向:AGGCTGCCTTAAAACCCCAG
反向:TGAGGTCAACACGATTTCCGT114 XR_923639 正向:GGTTCCATCCCATCCGCCT
反向:AAAAACCGCAGAGTCCACCT202 XR_01739734 正向:AGCGACAAAGACGGTTTCCT
反向:ACCTTTTCCGCCAGTGCATA264 XR_923426 正向:GAAGTGGGACAGGGAGCATT
反向:CAGTAGGCTTGTTCCTTGCC129 -
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